为提升行业学术水平及研究能力，北京大学第一医院肾内科拟于2022年10月7日至2023年10月6日开展“直接肾素抑制剂对于狼疮性肾炎继发血栓性微血管病的靶向治疗”的课题研究。

项目背景：

系统性红斑狼疮是我国最常见的自身免疫性疾病之一，狼疮性肾炎（lupus nephritis, LN）是其常见且严重的并发症，是我国继发性肾小球病的首要病因 [1]。LN的肾脏病变可以累及肾小球、肾小管、肾间质以及肾脏微血管。狼疮性肾炎的微血管病变受累比例高、受累面积广且病变种类复杂多样，近年来已经成为国内外相关领域的研究热点。在众多类型的微血管病变中，本项目组既往研究发现血栓性微血管病（thrombotic microangiopathies, TMA）可占LN患者微血管病变总数的近20％。更为重要的是，这类患者临床表现重、疾病进展迅速，如得不到及时诊治，短期内往往会进展成为尿毒症甚至威胁生命。但遗憾的是，现有的各项权威专业指南对其推荐的治疗方案，效果往往差强人意，临床有效率不足10%。鉴于LN继发TMA的病因目前尚不清楚，明确其“精准”的发病机制及寻找相应的靶向治疗对改善该类患者的临床预后迫在眉睫。

补体系统是天然免疫系统的第一道“防线”，共存在三种激活途径：经典途径、旁路途径及凝集素途径，涉及已知的30余种血浆蛋白参与（图1）。为了防止补体系统过度活化对机体本身造成的损伤，在该系统中还存在许多调节蛋白，其中，H因子是最为主要的抑制因子。H因子是一种由20个短的相同重复片段（short consensus repeats, SCRs）结构域组成、分子量为150 kDa的糖蛋白，主要在肝脏合成。H因子不同的SCRs可以与肝素、细胞表面的粘多糖、许多微生物表面的蛋白以及C3b、C3d等补体分子相结合，发挥其复杂的生物学功能。其N端SCR1-4区域主要在液相中参与旁路途径C3转化酶的降解及抑制C3转化酶形成，防止补体“瀑布”效应的爆发；其C端SCR19-20区域主要和宿主细胞（如血管内皮细胞）结合，从而利于N端SCR1-4在宿主细胞的表面抑制补体旁路途径的过度活化，保护宿主细胞免受损伤。

本项目组建立了良好的LN人群队列，对LN继发TMA患者进行了系统性临床描述、预后追踪及机制研究。在其中一项对于36例存在肾血管TMA病变的LN患者的研究中，我们发现：有19例患者（53%）存在肾脏病理微血管壁C4d沉积，17例患者（47%）血清中H因子水平显著下降，而9例患者同时存在以上两种现象；这9例同时存在血管壁C4d沉积以及血清中H因子水平显著下降的TMA患者相比于其他TMA患者预后更差（P= 0.007）。（本部分工作已经发表在英国风湿病学专业杂志Arthritis Research & Therapy，影响因子：5.156）。本项目组进一步提纯了LN继发TMA患者血浆中的H因子，研究发现其存在生物学功能缺陷，包括与C3b、mCRP的结合能力以及保护绵羊红细胞溶血的能力显著减低，H因子外显子测序发现存在SCR5、SCR7、SCR8、SCR20的基因变异 。回顾性研究发现60%的LN继发TMA存在补体基因变异，依库珠单抗（抗C5单抗）治疗有效 [8, 9]。近期研究发现H因子基因变异可造成肾脏内皮细胞功能异常 。上述结果提示补体系统的过度活化、特别是H因子的功能异常在LN继发TMA的发病过程中可能发挥重要作用。

补体旁路途径的活化除传统的C3转换酶（C3bBb）剪切C3以外，还存在非传统的外源性或内源性C3剪切酶，如一些细菌蛋白酶和胰蛋白酶、类胰蛋白酶、激肽释放酶、凝血因子和胞浆素等。既往研究表明激肽释放酶剪切C3后产生的C3a和C3b具有生物活性，激肽释放酶可直接激活补体旁路途径，过度表达可能导致补体旁路途径的过度活化。肾素是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）的重要组成成分，近年来在C3肾小球病（C3G）的研究中发现肾素具有C3剪切酶功能，与激肽释放酶类似，剪切C3的位点与传统的C3转化酶相同。

肾素主要由肾小球球旁器细胞合成，集合管也有部分表达。肝脏、生殖道、卵巢、蜕膜、胎盘也发现有肾素表达。肾素是一种天门冬氨酸蛋白酶，由340个氨基酸组成，分子量为45 kDa。无活性的肾素原于球旁器细胞中剪切N端43个氨基酸后形成肾素，循环中肾素原水平显著高于肾素水平。肾素原和肾素可结合肾素原受体。从N末端切割血管紧张素原，生成血管紧张素I（Ang I），Ang I可被血管紧张素转换酶（ACE）等剪切产生血管紧张素II（Ang II）。Ang II介导血管收缩以及肾上腺释放醛固酮，从而导致水钠潴留和血压升高。Ang II通过与2种特异性Ang II受体结合发挥作用，即Ang II的1型受体（AT1R）和2型受体（AT2R）。血管紧张素II的绝大部分作用由AT1R介导，肾素与肾素原受体结合后其剪切血管紧张素原的能力增加4倍，也可引发与血管紧张素产生无关的细胞内信号传导，刺激细胞增殖。肾脏灌注不足以及交感神经兴奋性增加是刺激肾素分泌的主要生理因素。肾脏局部RAS的异常活化是高血压及很多肾脏疾病的重要发病机制。

阿利吉仑是非肽类直接肾素抑制剂，生物利用度约为2.5%，通过降低血浆肾素活性而阻止血管紧张素原转化为Ang I，影响有较强生物活性的Ang II生成，进而减少RAS中下游所有有生物活性的内源性物质生成。而RAS下游抑制剂会因阻断了对肾素的负反馈效应，促进肾素表达，例如临床常用的血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEI）或Ang II受体阻滞剂。Imarikiren是一种新型的直接肾素抑制剂，作用机制与阿利吉伦类似，但由于其药代动力学更为稳定，对于血浆肾素活性的抑制性更强。其有13-17%经尿液排出，与阿利吉仑相比，具有较高的生物利用度（77%）。

基于以上证据和发现，我们提出以下科学假说：狼疮性肾炎（LN）继发血栓性微血管病（TMA）患者存在补体调节蛋白或补体蛋白基因突变，肾脏局部肾素积聚，肾素通过剪切C3，进一步激活补体旁路途径，形成C5b-9造成内皮细胞损伤；肾素抑制剂可以抑制肾素剪切C3，同时可减轻肾脏局部炎症。本项目拟在前期研究基础上，明确LN继发TMA人群遗传背景、循环及肾脏补体活化水平以及肾素（原）、肾素（原）受体和清除受体表达情况；建立LN继发TMA“病人特异性”诱导多能干细胞衍生的内皮细胞（iPSC-EC）模型，阐明直接肾素抑制剂Imarikiren对于内皮细胞的保护作用及其分子机制；应用降植烷诱导补体H因子杂合突变小鼠构建LN继发TMA模型，验证直接肾素抑制剂Imarikiren在小鼠模型中的治疗作用，以期达到发现潜在治疗靶点的目的。本项目将为LN继发性TMA的发病机制提供新的理论基础及可能探索的方向，并为LN继发性TMA的个体化治疗提供新的分子靶点，提高治疗的有效性，指导病人用药。同时，本项目的成功也将为其它继发性TMA的研究提供全新的观念和研究思路。总体上，本项目不仅具有较强的科学意义，而且具有较强的转化医学研究价值。

二、研究内容：

1、研究内容

研究内容1：研究LN继发TMA人群遗传背景，循环及肾脏补体活化水平以及肾素（原）、肾素（原）受体和清除受体表达情况。

研究内容2：建立LN继发TMA“病人特异性”的iPSC-EC模型，研究肾素抑制剂对于内皮细胞的保护作用及其分子机制。

研究内容3：应用降植烷诱导补体H因子杂合突变小鼠构建LN继发TMA模型，验证直接肾素抑制剂Imarikiren在小鼠模型中的治疗作用。

三、研究方法：

1) 研究内容1：研究LN继发TMA人群遗传背景，循环及肾脏补体活化水平以及肾素（原）、肾素（原）受体和清除受体表达情况。

检测人群：a) 正常人对照；b) LN无TMA患者；c) LN继发TMA患者；d) aHUS患者。

检测LN继发TMA患者是否携带补体和肾素相关基因突变。

补体活化水平的检测。

肾素（原）及其受体检测。

2) 研究内容2：建立LN继发TMA“病人特异性”的iPSC-EC模型，研究肾素抑制剂对于内皮细胞的保护作用及其分子机制。

人成纤维细胞的原代培养以及iPSC的诱导、传代、扩增和冻存。

iPSC的多能性鉴定。

iPSC核型分析。

iPSC的内皮定向分化。

内皮细胞MACS。

内皮细胞免疫荧光染色。

内皮细胞功能检测实验。

qPCR检测表达水平。

体外实验检测肾素对内皮细胞补体活化的影响，明确直接肾素抑制剂Imarikiren是否存在抑制作用

3) 研究内容3：应用降植烷诱导补体H因子杂合突变小鼠构建LN继发TMA模型，验证直接肾素抑制剂Imarikiren在小鼠模型中的治疗作用。

2、可行性分析

（1）主要研究者于峰，博士，北京大学第一医院肾内科教授、主任医师，中国老年学和老年医学学会泌尿和肾病分会 副主任委员、中华预防医学会肾脏病预防与控制专业委员会 常务委员、中国医师协会循证医学专业委员会肾科学组 委员，将为本项目提供指导。

（2）申请者所在医院北京大学第一医院肾脏内科暨北京大学肾脏病研究所是国家首批博士学科点，卫生部肾脏疾病重点实验室，北京市及国家重点学科。合作者所在的免疫研究室拥有进行蛋白质组学、细胞及分子生物学研究的设备、人员和技术；有完成上述工作的多数关键设备及材料，如AKTA-FPLC蛋白分离系统、各种主要层析柱、RT-PCR仪、共聚焦荧光显微镜、流式细胞仪、细胞分离仪、动物实验设施及病理标本处理系统。本所内还设有病理，病生理，细胞生物学和分子遗传学等研究室，技术成熟，并与北京大学第一医院中心实验室、北京大学医学部免疫学系、北京大学生命科学院有良好的合作。此外，本项目组与美国宾夕法尼亚大学宋文超教授实验室有良好的横向合作。本研究动物试验部分中动物模型的建立将在宋文超教授的指导与支持下进行，在本医院实验动物中心常规饲养及传代。本医院实验室动物中心具备有实验动物建模、饲养、传代、血尿标本采集、动物手术及病理标本处理系统等条件。可提供完成本研究所需的各项操作的设备、人员和技术支持。本研究中心多年来一直开展狼疮性肾炎和补体相关肾脏病发病机制的系列研究，目前在相关领域已发表SCI论文40余篇，在狼疮性肾炎和补体相关肾脏病研究领域有丰富的研究经验和高素质的研究团队，申请者是狼疮性肾炎和补体相关肾脏病研究团队的骨干成员。

四、研究计划

2022.10-2022.11

完成LN继发TMA人群遗传背景检测。

完成LN继发TMA人群补体水平检测。

完成LN继发TMA人群肾组织补体活化检测。

完成LN继发TMA人群肾素（原）及其受体水平检测。

2022.11-2023.1

经病人所在医院医学伦理委员会通过和病人知情同意之后，收集病人皮肤样本，应用体细胞重编程技术建立病人特异的iPS细胞株并进行系统性鉴定，应用内皮定向分化技术获得病人特异的内皮细胞。

完成正常人组和病人组内皮细胞功能学差异分析，揭示病人组内皮细胞的表型特征。

完成直接肾素抑制剂Imarikiren对于内皮细胞的保护作用及其分子机制研究。

2023.1-2023.10

应用降植烷诱导补体H因子杂合突变小鼠构建LN继发TMA模型。

验证直接肾素抑制剂Imarikiren在小鼠模型中的治疗作用。

完成项目总结及论文的撰写。

五、预期研究结果

1) 明确LN继发TMA人群遗传背景，循环及肾脏补体活化水平以及肾素（原）、肾素（原）受体和清除受体表达情况。

2) 建立LN继发TMA“病人特异性”iPS细胞株，揭示LN继发TMA“病人特异性”iPSC-ECs的疾病表型特征，阐明直接肾素抑制剂Imarikiren对于LN继发TMA内皮细胞保护作用的分子机制。

3) 应用降植烷诱导补体H因子杂合突变小鼠构建LN继发TMA模型，明确直接肾素抑制剂Imarikiren在小鼠模型中的治疗作用。

4) 预期在国际高水平学术刊物发表SCI论文1-2篇。

5) 培养研究生1名，培养其他技术人员和科研骨干1名。

六、联系方式

中关村精准医学基金会  刘琦  13811902542

中关村精准医学基金会

2022年8月